癌症治疗新思路!基因测序不好使，肿瘤细胞直接试药
精准医学(Precision medicine)是近来热度非常高的一个词汇。得益于基因测序技术的进步，它萌发于学术科研中心，应用在生物医药产业，更是广泛出现在各大新闻媒体当中为百姓所熟知，甚至一度成为了最热门的政治口号。然而，由于癌细胞基因的不稳定性，仅仅采用基因测序这种间接方式，在大多数情况下并不足以给出最合理的用药方案。而精准医疗不仅仅是基因测序，还包括了多层面医疗技术的使用。通过培养个体的肿瘤细胞，并进行干预或扰动，从而得到重要的功能性信息，这是功能性精准医学的特点。利用肿瘤原代细胞体外培养模型对候选药物或药物组合进行精确的药理分析和药效检测，也将成为一种更为直接、更为准确的肿瘤诊治模式。
到底什么是精准医学?
也许最直接的回答可以是“找到与每一位患者匹配度最高的用药方式的过程”。具体到癌症精准医学领域，也许可以理解为“根据每一位患者的不同情况，找到最大程度减小肿瘤体积或者清除患者肿瘤的治疗方法”。
2015年美国联邦政府首次提出2016精准医学倡议以及2020癌症登月计划。同年，世界上相继有很多国家陆续提出了自己的精准医学计划并投入巨资开展研究。但就在同年，不同的声音也开始陆续发生在权威杂志上。
例如2016年9月，新英格兰医学杂志发表评论文章”Limits to Personalized Cancer Medicine”回顾了过去一段时间以来精准医学和传统医学的比较研究，提出“参与治疗的患者并没有从精准医学(或者严格的说是从基因组测序)中获益”这一非常让人吃惊并且沮丧的结论(Tannock and Hickman, 2016)。
基因组学推动“癌症的精准医学”的发展
一提起“癌症的精准医疗”，人们大多会想起当下最流行的“组学研究”(”omics research”)。美国国立癌症研究院(National Cancer Institute, NCI)是这样定义精准医学计划的”Precision medicine uses the genetics of disease to identify effective therapies, and, thanks in large part to NCI-supported research, we know that cancer is a disease of the genome.” 从这句话可以看出，基因组学在当下被认为是精准医学在癌症治疗领域里唯一可以利用的工具。
基因组学医疗的建立是基于一个非常基本的想法，通过测序找到遗传学上的改变(包括点突变，删除，扩增，移位以及定量染色体异常等)，进而找到与这个遗传变化对应的靶向药物，从而使患者从中受益。
一个非常有名的例子就是2001年报道的，人们发现有一类chronic myeloid leukemia (CML)患者具有t(9;22)移位突变，从而造成BCR-ABL fusion kinase，由此推导出的用BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor imatinib治疗该类患者的临床效果非常显著，54人中有53人在治疗的头四周就出现了明显的血液学反应， (Druker et al.,2001)。
由此开始，从本世纪初，就逐渐形成了基因组学精准医疗的雏形，即癌症生物学家鉴定出患者的体细胞遗传突变，然后用靶向该突变的药物去治疗患者，从而使癌症得到控制。
除此之外，还有一些比较有名的例子，比如具有EGFR突变的肺癌患者会在使用EGFR抑制剂后受益(Lynch et al., 2004)， (Flaherty et al.,2010)。
在典型的Hodgkin’s lymphoma患者中经常会发现在9p24.1 locus处存在基因突变，造成PD-1 ligands的高表达，从而造成肿瘤细胞的免疫逃逸。这一基因组学的发现，促使科学家首次尝试使用PD-1 blocking antibody去治疗Hodgkin’s lymphoma，并在传统治疗方法无效的情况下在患者身上观察到了不俗的反应(Armand et al., 2016;Younes et al., 2016)。
类似的，在大肠癌的研究中，科学家发现微卫星不稳定(microsatellite instability)可以作为患者是否对免疫检验点抑制治疗敏感的标记(Llosa et al., 2015)。尽管上面大多数的例子中，患者获益的完全程度和持久程度还不足以令人满意，但毫无疑问基于基因组学的这一系列发现给患者的治疗提供了新的选择和新的希望。
可以非常肯定的说，基于临床遗传数据和基因组学的精准医学在过去的十几年的时间里已经使许多患者从中受益，并在特定癌症亚型中挽救了许多患者的生命。但是在当下，基因组学真的能独自担负起精准医学的重任吗?
基因组学整体临床效果还不突出尽管可以通过比较基因组学比较容易的发现“可作用的突变”，却很难得到这些“可作用突变”的发现让癌症患者真正从中受益的证据。
最近比较有名的一个案例是SHIVA (Molecularly targeted therapy based on tumour molecular profiling versus conventional therapy for advanced cancer)临床治疗实验(Le Tourneau et al., 2015)，该实验属于前瞻性随机对照临床2期实验，分别在位于法国的8个学术研究中心进行。
在该实验中总共有741个肿瘤样本用来进行遗传突变的筛选。在这些肿瘤样本中，有大约40%测出具有用于靶向治疗的基因突变。然后把这40%的肿瘤样本随机分组，
一部分用于基因组学指导的分子靶向治疗(实验组)，另一部分则用于临床医生根据经验的传统治疗方式(对照组)。
初步结果显示，实验组和对照组之间的无进展生存期(Progression-free survival)并无显著差异(2.3 versus 2.0 months, P=0.41)(Tsimberidou and Kurzrock,2015)。
尽管这一实验还存在一些争议和局限，比如如何处理同时发现的突变，如何选择靶向药物等问题，但却至少说明在当下，基于基因组学的精准医学并没有像人们所期望的那样使癌症患者从中受益。
暂且不论临床效果，单从通过基因组学成功将患者指向某种靶向治疗的概率角度讨论，该种方法的成功率在当下技术手段下也不能让人满意。2016年5月，NCI-MATCH临床试验(the Molecular Analysis for Therapy Choice)发布了其中期的研究数据。在739个肿瘤样品中，有87%成功完成了基因组测试，但却只有9%的患者拥有在当前条件下可用于靶向治疗的基因突变，最终更是只有2.5%的患者真正进入了对应的临床试验(Meric-Bernstam et al., 2015)。
回顾肿瘤治疗药物的历史，我们会发现大多数药物其实并不是通过在个体中挖掘遗传突变而发现的。治疗白血病、淋巴瘤临床化疗药物的发现并没有遗传突变的参考。
也许我们会纠结于通过基因组的精准医学是否会加速上述这些药物的发现时间，但不可否认的是预测性生物标记物的缺乏是导致基因组学失效的根本原因。
如果将视野转向Chronic lymphocytic leukemia (CLL)治疗领域发现的新药，靶向CD20, phosphoinositide 3-kinase(PI3K), Bruton’s tyrosine kinase (BTK)以及B cell lymphoma 2 (BCL-2)的药物在近几年逐步获得了US Food and Drug Administration (FDA)的批准(Jain and O'Brien, 2016)。
除了在CLL治疗领域有比较好的临床效果之外，它们之间的一个共性就是这些药物的靶向分子或通路并没有在CLL样本中发现存在突变。这些也暗示在肿瘤中存在非遗传突变的易受攻击位点，理所当然的，精准医学需要发展不基于遗传的实验手段去发现这类药物。
由此，我们可以说为了让大多数，而不只是一小部分，癌症患者通过精准医学找到适合自己的有效药物，精准医学急需不仅仅依赖于基因组检测的，而是基于发现癌症细胞易受攻击位点的功能性方法。
什么是功能性精准医学
功能性精准医学的特点是对个体的肿瘤细胞进行干预或扰动，从而得到重要的功能性信息。与基因组学的最大差异就是，基因组学是对肿瘤细胞的静态测量，而功能性精准医学强调的是测量在干扰过程中肿瘤细胞对药物的动态反应。
比如，在一个相对简单的场景中，我们可以根据球体的起始下落高度，由牛顿力学准确预测球体到达地面的速度。但是在更为复杂的系统中，如果对某一物体施加力的影响的因素多于3个，且每个力都具有不确定性，就很难根据球体的起始位置准确推断物体的末速度。
值得注意的是，判断细胞对药物的反应，这一过程涉及到的胞内信号分子可能更为复杂，更加增加了由起始状态进行预测的难度。
在复杂系统中，对于上述问题的策略非常直截了当，即直接将干扰施加在复杂系统当中，然后仔细测量接下来会发生什么。可以想象一下，如果我们尝试预测用棍子戳一只小狗后每只小狗狗的不同反应。很难想象，按照现在的场景，我们杀掉这只狗狗，然后取细胞进行基因组测序，由测序产生的数以TB的大数据去预测狗狗的反应。相反，最切实可行的办法就是用一个棍子戳一下小狗，然后观察会发生什么。后者就是一个典型的功能性精准医学的案例，不但数据量更小，更重要的是更相关、更可行。
在癌症治疗领域，这个用于干扰的“棍子”可以是一种药物，也可以是若干种药物的组合。由此可以看出，也许功能性精准医学在当下可以作为基于基因组学的精准医学的有益补充。
功能性精准医学也面临着一系列亟待解决的科学问题，：糖尿病网小编列出如下两个问题，将在后文中进行进一步讨论：如何将药物施加在肿瘤细胞上?以及在药物处理后应该测量什么? 几十年来，我们知道给患者选择施用抗生素的金标准就是通过在体外培养细菌，然后直接将该微生物直接暴露在不同的抗生素下，观察与测量细菌的生长抑制。
同理，抗肿瘤药物的选择也遵循同样的法则。但是不同于细菌，原代肿瘤细胞在体外很难生长，这是一个有趣的悖论和共识：”human carcinomas that grow uncontrollably in the body are often paradoxically difficult to grow in cell culture”。
至于用什么标准来测量肿瘤的生长抑制也存在争议，至今没有一个较好的readout能与临床效果较好的吻合起来。比如常用的MTT assays, ATP abundance，[3H]thymidine incorporation等无法用来特异性的区分细胞死亡，细胞周期停滞或者在代谢中产生的获得性变异等(Samson et al., 2004)。
J. Tyner, Oregon Health & ScienceUniversity进行的一项研究中，研究者用2D培养的方式测量151个CLL白血病样本对170个靶向药物的反应，在最终的结果中他们发现>70%的样本可以找到对应有效的激酶抑制剂，但这些样本中只有13%可以用对应的基因组测序结果解释。这些数据在进一步的临床实验中进一步体现出了该体系的可应用性。(NCT02779283,https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02779283?term=NCT02779283&rank=1) 在芬兰Wennerberg实验组，应用类似的实验体系也对白血病样品独立开发了药物检测平台，并将其命名为Drug Sensitivity and Resistance Testing (DSRT)。该平台还独创了根据area under dose-response curves计算的药物敏感度算法Drug Sensitivity Score(DSS)(Pemovska et al., 2013;Yadav et al., 2014)。
不得不承认，上述方法都毫无例外的是针对白血病样本，尽管有文献报道对实体瘤样本进行类似的药物敏感度检测(Crystal et al., 2014; Yuet al., 2014)，但由于实体瘤临床样本获取难、分离培养效率低等因素限制，只能局限在研究领域，很难进行临床产业转化。
除了2D培养方式，由于3D培养方式更接近细胞组织的生理环境，近年来在该技术领域获得了长足的发展。由荷兰的Hans Clevers实验组领衔建立的3D organoid方法受到越来越多的关注。该方法利用Stem Cell technology，可以从非常少量的细胞(甚至是单细胞)起始建立培养体系，已经应用在肠癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌等实体瘤领域(Dutta et al., 2017)。但该方法也存在培养时间长、起始建立效率低等明显的缺点。
PDX (Patient-derived xenograft)是肿瘤治疗领域临床前检测的金标准，为临床试验提供了非常有价值的信息。通过PDX评价肿瘤细胞对药物的反应，不同与体外培养的方式，更接近生理环境，是对药物反应在复杂有机体内综合评价的有效工具。但应用PDX进行药物评价有先天的不足，比如时间成本、移植成功率(13%-90% depending on tumor type and technique)、实验成本等(Hidalgo et al., 2014)。
i- CR技术平台是基于CR(条件性重编程conditional reprogramming)原理研发出的新一代肿瘤原代细胞培养技术。构建了一套全新的培养体系，能够让上皮来源的肿瘤原代细胞突破传代限制。培养的肿瘤原代细胞不仅可以帮助科学家们更好地理解疾病的分子机理，产生原因，还可以协助药物发现和新疗法的开发。
我们希望精准医学在广泛结合医生临床经验、静态”omics”组学分析以及功能性assay的条件下，至少在当下，会走向更加成熟的未来。
参考资料：Armand, P., Shipp, M.A., Ribrag, V., Michot, J.M., Zinzani, P.L., Kuruvilla, J., Snyder, E.S., Ricart, A.D., Balakumaran, A., Rose, S., et al. (2016). Programmed Death-1 Blockade With Pembrolizumab in Patients With Classical Hodgkin Lymphoma After Brentuximab Vedotin Failure. J Clin Oncol 34, 3733-3739.Crystal, A.S., Shaw, A.T., Sequist, L.V., Friboulet, L., Niederst, M.J., Lockerman, E.L., Frias, R.L., Gainor, J.F., Amzallag, A., Greninger, P., et al. (2014). Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer. Science 346, 1480-1486.Druker, B.J., Talpaz, M., Resta, D.J., Peng, B., Buchdunger, E., Ford, J.M., Lydon, N.B., Kantarjian, H., Capdeville, R., Ohno-Jones, S., et al. (2001). Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 344, 1031-1037.Dutta, D., Heo, I., and Clevers, H. (2017). Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends Mol Med 23, 393-410.Flaherty, K.T., Puzanov, I., Kim, K.B., Ribas, A., McArthur, G.A., Sosman, J.A., O'Dwyer, P.J., Lee, R.J., Grippo, J.F., Nolop, K., et al. (2010). Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N Engl J Med 363, 809-819.Hidalgo, M., Amant, F., Biankin, A.V., Budinska, E., Byrne, A.T., Caldas, C., Clarke, R.B., de Jong, S., Jonkers, J., Maelandsmo, G.M., et al. (2014). Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov 4, 998-1013.Jain, N., and O'Brien, S. (2016). Targeted therapies for CLL: Practical issues with the changing treatment paradigm. Blood Rev 30, 233-244.Kern, D.H., and Weisenthal, L.M. (1990). Highly specific prediction of antineoplastic drug resistance with an in vitro assay using suprapharmacologic drug exposures. J Natl Cancer Inst 82, 582-588.Le Tourneau, C., Belin, L., Paoletti, X., Bieche, I., and Kamal, M. (2015). Precision medicine: lessons learned from the SHIVA trial - Authors' reply. Lancet Oncol 16, e581-582.Llosa, N.J., Cruise, M., Tam, A., Wicks, E.C., Hechenbleikner, E.M., Taube, J.M., Blosser, R.L., Fan, H., Wang, H., Luber, B.S., et al. (2015). The vigorous immune microenvironment of microsatellite instable colon cancer is balanced by multiple counter-inhibitory checkpoints. Cancer Discov 5, 43-51.Lynch, T.J., Bell, D.W., Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, R.A., Brannigan, B.W., Harris, P.L., Haserlat, S.M., Supko, J.G., Haluska, F.G., et al. (2004). Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 350, 2129-2139.Meric-Bernstam, F., Johnson, A., Holla, V., Bailey, A.M., Brusco, L., Chen, K., Routbort, M., Patel, K.P., Zeng, J., Kopetz, S., et al.(2015). A decision support framework for genomically informed investigational cancer therapy. J Natl Cancer Inst 107.Pemovska, T., Kontro, M., Yadav, B., Edgren, H., Eldfors, S., Szwajda, A., Almusa, H., Bespalov, M.M., Ellonen, P., Elonen, E., et al.(2013). Individualized systems medicine strategy to tailor treatments for patients with chemorefractory acute myeloid leukemia. Cancer Discov 3, 1416-1429.Samson, D.J., Seidenfeld, J., Ziegler, K., and Aronson, N. (2004). Chemotherapy sensitivity and resistance assays: a systematic review. J Clin Oncol 22, 3618-3630.Tannock, I.F., and Hickman, J.A. (2016). Limits to Personalized Cancer Medicine. N Engl J Med 375, 1289-1294.Tsimberidou, A.M., and Kurzrock, R. (2015). Precision medicine: lessons learned from the SHIVA trial. Lancet Oncol 16, e579-580.Yadav, B., Pemovska, T., Szwajda, A., Kulesskiy, E., Kontro, M., Karjalainen, R., Majumder, M.M., Malani, D., Murumagi, A., Knowles, J., et al. (2014). Quantitative scoring of differential drug sensitivity for individually optimized anticancer therapies. Sci Rep 4, 5193.Younes, A., Santoro, A., Shipp, M., Zinzani, P.L., Timmerman, J.M., Ansell, S., Armand, P., Fanale, M., Ratanatharathorn, V., Kuruvilla, J., et al. (2016). Nivolumab for classical Hodgkin's lymphoma after failure of both autologous stem-cell transplantation and brentuximab vedotin: a multicentre, multicohort, single-arm phase 2 trial. Lancet Oncol 17, 1283-1294.Yu, M., Bardia, A., Aceto, N., Bersani, F., Madden, M.W., Donaldson, M.C., Desai, R., Zhu, H., Comaills, V., Zheng, Z., et al.(2014). Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science 345, 216-220.Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens
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